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扫描电镜“生物样品”制作技术及讨论

2012-6-1 14:04| 发布者: 花瓣七七| 查看: 4257| 评论: 0|来自: 中国电镜网

摘要: 扫描电镜作为观察物体表面或断面超微结构的工具,在生物组织细胞研究中越来越受到重视,特别是一些分析配件的介入(如能谱仪等),更加使扫描电镜的应用范围进一步扩大,这也使得扫描电镜样品制作技术也要不断创新, ...

        扫描电镜作为观察物体表面或断面超微结构的工具,在生物组织细胞研究中越来越受到重视,特别是一些分析配件的介入(如能谱仪等),更加使扫描电镜的应用范围进一步扩大,这也使得扫描电镜样品制作技术也要不断创新,跟上现代研究的步伐。以下为取材相关内容:

一、组织和器官取材法: 

事先准备好所需的器械和固定液,并把它放在4度冰箱内备用。

 取材时,首先用锋利的刀片将组织从机体内取下,放在预先滴有固定液的蜡板上,利用双刀法进行修块。如果以观察组织细胞表面结构为主的样品,应特别要注意保护好观察面,尽量避免取材器械与待观察面的接触,样品可以大一些,但其直径不宜超过5毫米,高度在3毫米左右。如果以观察细胞内部超微结构的样品,样品大小在直径2毫米以内,高度在3毫米左右。同时要做好样品观察面的标记,否则,经过后续处理后会难以辨别观察面的位置。另外,移动样品可用无齿镊子或用牙签转移,特别是观察表面结构的样品必须用牙签转移。

标本清洗:

1. 固定前清洗法:是指表面覆盖有大量黏液和杂质的组织,在3%戊二醛固定之前进行清洗。清洗之前可用低浓度蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶等)或其他具有水解作用的溶液(N-乙酰半胱氨酸)对样品进行黏液处理,之后再选择等渗生理盐水或缓冲液在震荡器中进行清洗或用注射器加压冲洗,冲洗时间可根据样品附着物的情况来定。

2. 固定后清洗法:是指表面比较干净的组织,取材后经过戊二醛固定2小时之后,用等渗生理盐水或缓冲液进行冲洗。

3. 离心清洗法:是指游离细胞、微生物以及其他微小生物样品的清洗。具体步骤如下:将固定好的样品放入离心管内,注入等渗生理盐水或缓冲液(样品体积20倍的量),轻轻摇匀后,置4000/分钟的转速下离心3——5分钟,弃去上清夜,再注入上述清洗液,同样操作3——4次即可。

.注意事项

1. 由于扫描电镜对样品表面的要求非常严格,必须清洗干净,否则,可导致观察困难或错误判断。

2. 取材时要做到动作快、环境冷、部位准。固定前清洗的组织离体后应在2—3分钟清洗完毕并投入固定液内;固定后清洗的组织离体后应在1分钟以内投入固定液。固定液要预冷,取材部位必须准确。

3. 实验动物取材部位不宜多,否则会延误取材时间,导致组织自溶等人为假象的发生。

以下为扫描电镜样品制作的简单流程

取材(做好样品观察面的标志)——漂洗(生理盐水或缓冲液)——固定(3%戊二醛2小时以上)——漂洗(0.1M磷酸缓冲液,3次,45分钟)——后固定(1%锇酸,2小时)——酒精脱水(50%70%80%90%95%15分钟,换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟)——干燥(零界点干燥或冷冻干燥)——镀膜(真空镀膜仪或离子溅射仪


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